1.2 显微镜的使用

1、安装  右手握住镜臂，左手拖住镜座，小心地把显微镜放在桌子上稍偏身体的左方，离桌子边缘约为3—5厘米的地方，右侧放记录本或绘图纸。

2、对光  在正式观察前，先要对光，实验室中可利用灯光或自然光，但不能利用直射的太阳光，以免损伤眼睛。对光时，转动转换器使低倍物镜正对通光孔，同时转动载物台下面的遮光器，让一个较大的光圈对准通光孔，然后用左眼朝目镜里注视。光线强时，让平面镜对准光源，光线弱时，让凹面镜对准光源，这时从目镜里可以看到一个明亮的圆形视野。只要视野里的光亮程度合适，光就对好了。

3、观察  把装片或切片放在载物台上，把要观察的部分移到通光孔处，然后将装片或切片的两端用压片夹压紧。观察时，先用低倍物镜。为了保护物镜和不使物镜压碎切片，可以一方面从侧面注视物镜与制片的距离，一方面逐渐转动粗准焦螺旋使镜筒下降，直至接近盖玻片。然后用左眼向目镜里注视，同时反方向地转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看见装片或切片中的物象为止。为了看清楚物象，可轻微地转动细准焦螺旋，一般旋转不要大于180度。

在低倍物镜下找到所要观察的物象以后，如果需要更加仔细地观察某个部分，可将这一部分移到视野中央。然后转动转换器，把高倍物镜换到通光孔上方，再进行观察。如果看不清楚，可来回转动细准焦螺旋，直到物象清晰为止。

看到物象以后，还要用光圈来调节光束。光束粗大，光线过强，可使透明的物象不易察见。如果光束过小，光量不足，可使物象灰暗不清，因此调节光圈可以达到更好的观察效果。

4、物镜和目镜的合理搭配

  在选配物镜和目镜时,主要考虑两个问题：第一,类别上的匹配  即所有的平场物镜,都要与特制的平场目镜配合使用。第二,放大倍数的合理匹配 在一定的放大倍率下,物镜和目镜可任意组合,但其组合的前提,主要是考虑有效放大率,这是正确使用光学显微镜的一个重要法则。显微镜的有效放大率,为所用物镜数值孔径500～700倍,最大也不能超过1000倍，即物镜和目镜的放大倍数的乘积等于该物镜数值孔径的500～1000倍。假如你使用数值孔径为0.65的40x物镜观察标本时,应选多大的目镜与物镜合理匹配呢?首先依据有效放大率求出有效总倍数,再被40除,即为应选择目镜的倍数。计算过程为:(0.65×500～0.65×700)÷40≈8～11，应选8～11倍的目镜,最大不超过16倍。也就是说:数值孔径为0.65的物镜,在有效放大率(500～1000倍)的范围内应选用8～16倍的目镜与之匹配。如果目镜倍数太低,总放大倍数太小,物镜的分辨率不能充分发挥,本来可以辨认的细节,由于总放大倍数太小,挤在一起难以分辨。而高于16倍的目镜所得放大倍数叫做 “空的放大”,对影象细节的分辨,没有丝毫提高,反而清晰的深度小,不能清晰反映不同水平层次的结构。

在使用光学显微镜观察微细结构时,欲增加其分辨力,只有改用数值孔径更大的物镜─—油镜。如用数值孔径为1.25的90倍油镜与7x目镜组合,总放大倍数为630倍,分辨力为0.22um。若用40/0.65 的物镜与16x目镜组合,总放大倍数为640倍,但其分辨力只有0.42um。尽管总放大倍数很相近,对物像微细结构的分辨力几乎相差一倍。

总之,选择物镜和目镜主要考虑有效放大率,并着眼于提高物体影象的分辨率和清晰度,当清晰深度和视野宽度不足时首先调换目镜,然后再考虑降低物镜倍率、降低数值孔径或放大倍数。

显微镜辨别微小结构的能力和细节,取决于分辨率,不在于放大倍数；分辨率决定于物镜,而于目镜无关。显微镜的分辨率与物镜数值孔径成正比,物镜数值孔径与物镜倍数和分辨率的关系如下：

物镜倍数      4x      10x     20x     40x      90x     100x

  数值孔径      0.1     0.25    0.40    0.65     1.25     1.30

  分辨率um     2.75     1.1     0.68    0.24     0.22    0.21

5、显微测量

（1）塑料直尺的粗略测量方法

①把塑料直尺放在载物台上，使有刻度的一面放于通光孔的中央。用低倍物镜调好焦距后，算出视野的直径为多少毫米，再换算出微米。然后把要观察的标本放在低倍物镜（10倍）下，调整到看清楚并使细胞横放在视野直径的位置上，看看一个细胞的长度是直径的几分之几？即可粗略的测出细胞的大小。

②由于直尺上的刻度在高倍物镜下不清晰，所以高倍物镜的视野直径只能按比例计算。即计算高倍物镜和低倍物镜的放大倍数之比来求得。如果高倍物镜为45倍，低倍物镜为10倍，两者之比为4.5比1,同一物体高倍物镜下的视野是低倍物镜下的

1  4.5。假如已知低倍物镜的视野直径是2250微米的话，那么高倍物镜的视野直径应该是： 2250× 1  4.5=500微米。

（2）显微测微尺的测量方法

显微测微尺是在显微镜下细微结构的测微工具，用来测量细胞各部分的大小。

显微测微尺包括目镜测微尺（目尺）和物镜测微尺（台尺）。测量时须将其配合使用可达到测量的目的。目镜测微尺为一圆形玻片，玻片中央有一横线刻有大小格的等距离线（图2）。物镜测微尺为一特制的玻片，中央圆圈内有一个1毫米（mm）长分为100个等距离小格的刻线，每一个小格即为10微米（µm）（图3）

图2  目镜测微尺                图3  物镜测微尺

测量方法：首先须算出目镜测微尺的每一格在不同的物镜下各为多少微米。即取下接目镜卸下透镜，装上目镜测微尺，再把镜卸下的透镜安装上去。然后将物镜测微尺放在镜台中央，注视目镜，调好焦距，使两种测微尺的刻度平行并重叠在一起。按下面公式计算出目镜测微尺每格的实际长度。

计算出目镜测微尺每格的实际长度后，再在镜台上放上需要测量的物体标本或玻片标本，即可用目镜测微尺测出它们的长度。