3.5 果蝇唾液腺染色体制片与观察

【目的要求】

1、  练习解剖果蝇幼虫、分离唾液腺的方法

2、  掌握唾液腺染色体的制片技术

3、 了解唾液腺染色体的特点

【实验原理】

果蝇唾液腺染色体是永久性间期染色体，由于间期染色体不螺旋化，而且不断地进行复制，细胞并不进行分裂，这样就使唾液腺染色体变成了巨大的染色体（多线染色体），唾液腺染色体比果蝇的其它体细胞染色体要长100—200倍，体积大上千倍。果蝇唾液腺染色体能进行配对（拟联会），配对时所有染色体的着丝点聚集在一起形成染色中心。同源染色体的两条臂紧密结合，自由伸展。因此唾液腺细胞染色体数看不出2n的染色体数，只能观察到从染色中心向空间伸展的染色体臂。与其它细胞染色体相比的另一个特点是，唾液腺染色体上有深浅不同、宽窄不一的带纹，这些带纹的数目和位置是恒定的，代表着种的特征和一些基因的位置。由于这些带纹的存在，染色体上发生缺失、重复、倒位、易位等很容易在唾液腺染色体上识别出来。                    

【实验材料】  野生果蝇

【操作方法】

1、材料的准备

（1）野生型果蝇的招捕：准备几个干净的罐头瓶，把梨切成4—6块（腐烂发酵的水果也可以）放进一只瓶内，瓶口用塑料薄膜和橡筋圈扎紧，在薄膜的中央用铅笔穿一个小孔，然后把瓶子放在温暖的背风处（阳台或窗口外）。一两天内即可招捕到果蝇的成虫。当看到瓶内有几只雌雄果蝇活动时，立即用一团棉花，将瓶口薄膜中央的小孔堵住，以防成虫向外飞逃，带回实验室内。

（2）肥大三龄幼虫的简易培养：培养肥大三龄幼虫两个要点为：

①     培养温度应控制在16—18℃为宜。

②饲料中应补加酵母菌。取洁净经消毒的培养瓶一个，将鲜酵母（副食店有出售）一块放在30ml清水中 融化成乳状鲜酵母液，把切好的梨块的表面沾匀鲜酵母液，放在培养瓶里，可将此瓶放在20—25℃的温暖处，待一两天后酵母菌就会大量繁殖起来，从瓶中散发出发酵的香味。这时将已招捕来的果蝇成虫5—10对放进瓶里繁殖。从此时起，温度应控制的16—18℃为宜。15天后，瓶内陆续出现肥大三龄幼虫（成虫可放飞或移瓶）。为了让果蝇幼虫长得肥大更便于操作，在实验前的一天，将溶解好的酵母液添加在培养基里，添加的数量因培养基的情况而定，一般约0. 5—1ml。

2、剥离果蝇幼虫的唾液腺（图15）

取一洁净的载玻片，滴上1滴0.75%生理盐水。在瓶壁上挑选肥大的充分发育的三龄幼虫放在的生理盐水中，唾液腺位于幼虫食道的两侧，长度约占身体总长的1  3——1  4左右。解剖时把载玻片放在解剖镜或放大镜下,一手用解剖针压住头部(外型似一个黑色小点)，压住的地方越小越好，同时，用镊子夹住幼虫身体1  2处， 轻轻地将幼虫的头部自身体拉开。唾液腺随同内脏一起拉出。如果头部拉断,腺体没有拉出,可以用解剖针从镊子附近的腹部缓缓地向头端挤压,也可压出唾液腺。然后在镜下细心分离，理出双叉形半透明的囊状腺体即为唾液腺，在生理盐水中无论怎样触动它都不会发生形状改变。在显微镜下观察，由单层细胞构成，细胞形状不规则，细胞轮廓清晰，细胞大，细胞核也大，甚至可以看清细胞核是由染色体卷缩在一起形成的。唾液腺拉出后，剔除腺体周围乳白色的脂肪组织和身体的残留部分，只留唾液腺在载玻片上。

3、解离

用滤纸条吸净唾液腺周围的其它物质，然后将唾液腺放入1N HCl，解离2—3分钟，以松软组织利于细胞破裂，使染色体散开。

4、水洗

解离后的唾液腺用蒸馏水洗3—4次（或0.4%的生理盐水），水洗时要注意不要把唾液腺弄丢，水洗要彻底，目的是洗去盐酸，以免影响染色效果。另外水洗过程也是细胞低渗过程，使唾液腺细胞膨胀。

5、染色                                    

水洗后，用滤纸条将唾液腺周围清洗

干净，然后在唾液腺上滴一滴石炭酸品红，染色5分钟，如果气温太低，可把载玻片放在酒精灯上来回移动加温（不可煮沸），以加速染色。

6、压片

在染色好的材料上，盖上盖玻片，再用二三层滤纸吸去盖片周围溢出的染液，最后在材料位点上用手掌用力压片，使细胞中染色体散开，压片时注意不能移动盖玻片，必要时再压一次。

7、显微镜观察

先用低倍镜观察，找到分散好的染色体图像后换高倍物镜观察。  果蝇的体细胞染色体数为2n=12， 全部为端部着

丝点，其中有5对染色体臂较长，

一对染色体臂很小是点状染色体。唾液腺染色体是5条长臂，点状染色体附着在染色中心附近（16）。另外在染色体臂上有明显深浅不同、宽窄不同、粗细也不同的带纹，在染色体臂的不同部位有时会出现疏松区（胀泡），这是转录活性区。

讨论与思考

1、  你利用身边的材料怎样招捕野生型果蝇？

2、培养果蝇肥大三龄幼虫的温度范围是多少？

3、在果蝇唾液腺巨大染色体制片过程中，使用1N HCl解离和用蒸馏水水洗的目的分别是什么？

    4、能够使果蝇唾液腺巨大染色体着色的石炭酸品红，属于碱性染料；还是酸性染料？

   5、已知果蝇体细胞中有12条染色体，然而，实验结果所观察的果蝇唾液腺巨大染色体的数目却不是12条，这是为什么？